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明治二年（1869年）4月9日。
新政府军到达北海道，开始登陆作战。新政府军人多势众，加之武器精良，在一个月之内已经攻克江差、木古内等重要据点。
土方岁三和本武扬的军队被逼到函馆，败局已定。同本武扬一起离开江户，一直充当军事顾问的法国顾问布利奈也无力回天。他最终辞别了土方岁三和本武扬，登上法国军舰离开了北海道。
五月七日，函馆湾海战中，本军最后一艘完好无损的军舰回天也被新政府军的舰队击毁。幕府军只能坚守函馆，进行陆地攻防战。
5月11日，新政府军发动了函馆总攻击。新政府军分三路同时冲击本军的阵营，同时，停泊在七重浜的新政府军军舰“朝阳”、“丁卯”还不断向本军阵地发射火炮，以掩护新政府军前进。但是，新政府军万万没有想到，本军还有一艘名为“蟠龙”的军舰，它在函馆湾海战中因正在维护而未能出战，因此攻击力并未被破坏。在政府军的“朝阳”、“丁卯”向陆地密集发射火炮之时，“蟠龙”突然出现，并一炮击中猝不及防的“朝阳”舰。“朝阳”舰因炮击而爆炸，转眼陷入一片火海。正在冲锋的新政府军军士看见“朝阳”舰不但起火，还冒着浓烟不断下沉，不禁被吓得目瞪口呆。
此时，土方岁三率着援军刚刚赶到七重浜，看到新政府军士气受挫，顿时觉得是一个千载难逢的机会。他立刻离开七重浜，前去支援地势最为险要的函馆一本木关门。
土方岁三命在一本木关门镇守的原幕府陆军奉行添役大野右仲将残兵集合，从另一方向出击。自己则率领50名敢死队队员死守一本木关门，与新政府军激战。
土方岁三端坐马上，在枪林弹雨之中指挥自如，新政府军看到敢死队员悍不惧死，阵脚大乱。
但纵然千般英武，毕竟还是肉身，穿行在枪林弹雨中的土方岁三终于被流弹击中腹部，伤重落马。
身边的新选组队员岛田魁、相马主计等前去援助，将身受重伤的土方岁三扶起。满身是血的土方岁三慢慢抬起眼睛，轻声说了句：
“对不起”，便停止了呼吸。享年35岁。